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1 艱難梭菌簡介
艱難梭菌又叫“艱難梭狀芽孢桿菌”，最早發(fā)現(xiàn)于上世紀30年代，是造成醫(yī)院感染和住院病患腹瀉的常見。普通人群中約有3%的人的腸胃中都有這種細菌，在正常情況下，該細菌受制于人體內(nèi)的其他細菌，不會危害人體健康。但對于長期或是大量服用抗生素的病人而言，這種細菌是可怕的，甚至是致命的。這是由于藥物破壞了人體腸胃中各種菌類之間的平衡，所以容易導致“艱難梭菌”感染。就“艱難梭菌”本身而言，其致命性并不高，在0.6%到1.5%之間，但由于感染該細菌通常會伴隨偽膜性結腸炎的出現(xiàn)，一旦出現(xiàn)這種情況，死亡率就會猛增到35%到50%。而且，與所有的細菌一樣，“艱難梭菌”會通過突變產(chǎn)生新的變種，而這些變種細菌的毒性和對人體的危害性、致命性通常也更強。
2 艱難梭菌的傳統(tǒng)檢測方法
所有艱難梭菌菌株皆表達抗原谷氨酸脫氫酶，但是艱難梭菌分為產(chǎn)毒菌株和不產(chǎn)毒菌株兩種。僅產(chǎn)毒菌株分泌毒素A和毒素B。毒素A和毒素B都可以導致艱難梭菌相關疾病的發(fā)生。艱難梭菌的檢測主要是通過對疑似病例的糞便中毒素的檢測完成[1]。直接糞便毒素測定包括細胞毒素測定（CTA）和酶測定（EIA）[2]。CTA中毒素B的檢測被認為是艱難梭菌檢測的金標準[3]。CTA涉及到將培養(yǎng)的細胞暴露到有或者沒有抗毒素存在的排泄抽提物中。如果排泄物樣本是艱難梭菌陽性，則對沒有經(jīng)過抗毒處理的培養(yǎng)細胞有毒害作用[4]。
艱難梭菌也可以通過在厭氧條件下培養(yǎng)而被檢測。這種方法具有很高的靈敏度，但是也很耗費時間，需要超過三天的時間。另外，這種方法不能區(qū)分產(chǎn)毒菌株和非產(chǎn)毒菌株。利用EIA對細菌培養(yǎng)分離株進行進一步測試，主要是鑒定艱難梭菌菌株是否產(chǎn)毒 [5]。
傳統(tǒng)的C.diff測驗都是根據(jù)以下三種方法中的一種或者結合幾種進行的：細胞培養(yǎng)測定中的細胞毒素檢測； 艱難梭菌毒素A、腸毒素、或者毒素A和毒素B的酶免疫測定（EIA）檢測； 艱難梭菌的厭氧培養(yǎng)。[6]
2.1 細胞培養(yǎng)測定中的細胞毒素檢測
過濾的糞便抽提物加到微量滴定板上處于生長的健康的單層細胞中，培養(yǎng)48h。如果樣本中存在細胞毒素（一般是艱難梭菌毒素B），將會導致單層細胞聚集，脫離板（稱為細胞病變效應，CPE）。非特定細胞毒素的鑒別是通過加入向第二個孔（孔內(nèi)有病人的糞便抽提物）加入特定的抗毒素（實際上是培育一種相似的C. sordellii）。只有起始的CPE是由于艱難梭菌毒素B引起的，在相應的孔中抗毒素才會阻止CPE。一般認為，細胞毒素中和（CTN）測定是實驗室檢測中最靈敏和精確的，但是存在兩個主要的缺點：出結果的速度不夠快，從而影響了及時的臨床診斷；這種方法需要專業(yè)的技術和連續(xù)的組織培養(yǎng)[7]。
2.2 艱難梭菌毒素A、腸毒素、或毒素A和毒素B的酶免疫測定（EIA）檢測
一些商業(yè)產(chǎn)品通過檢測在主要存在于有生長力的艱難梭菌細胞的一種蛋白質(zhì)，叫谷氨酸脫氫酶（GDH），結合毒素檢測。因為糞便中的毒素易分解，特別是如果在轉(zhuǎn)移到實驗室的過程中經(jīng)過耽誤，毒素測驗很可能會錯誤地成陰性，然而GDH是相當穩(wěn)定的，通常可以表明微生物的存在。這種方法的缺點包括缺乏靈敏性，一些菌株毒素的改變使得不能被商業(yè)化產(chǎn)品檢測出來；一些無毒素的艱難梭菌也可分泌出GDH（假陽性結果）；一次進行這些檢測的費用；如果EIA測驗是成批進行以提高工作流程和成本效益，將會使周轉(zhuǎn)時間延長。
2.3 艱難梭菌的厭氧培養(yǎng)
培養(yǎng)是所有檢測中最靈敏的方法。但是必須進行二次檢測以判斷產(chǎn)物毒素是否存在，因為非毒性菌株還是比較常見的。這就延長了出結果的周轉(zhuǎn)時間。另外，艱難梭菌的芽孢是極其堅固的，但是有生長力的形式卻比較脆弱，必須維持厭氧環(huán)境以使其恢復生長。一種特殊的介質(zhì)——環(huán)絲氨酸-頭孢西丁果糖瓊膠（CCFA），必須在厭氧環(huán)境下儲存并培養(yǎng)48h，以達到最佳的恢復。因為培養(yǎng)技術的困難和結果輸出的延遲，在相對很少的檢測性實驗室中會對艱難梭菌進行培養(yǎng)。早先的研究區(qū)分疾病通常包括在內(nèi)鏡檢查術下宏觀觀察粘膜的外觀，通過組織病理學比較（假膜是由剝落的細胞組成的白色或者黃色粗糙的物質(zhì)構成），或者在結腸粘膜的活體組織上觀察到的的微觀病變。目前這種有擴散性的檢測在今天已經(jīng)幾乎不被利用了，實驗室測驗是檢測的主要模式。這使得測驗和標準的選擇至關重要。
最近已經(jīng)有文獻報道了采用兩步方法后的更好的結果：對微生物本身非常靈敏的檢測，首先利用EIA檢測GDH，緊接著對細胞毒素和中和的二次檢測。因為在所有病人的糞便標本中的艱難梭菌，對GDH的快速檢測將都是陽性的，不管毒素的性質(zhì)是否已經(jīng)在運輸過程中分解，這種方法是最靈敏的。糞便在其最初的檢測中被認為是陰性的，即可立刻被報告時陰性的。因為第一個樣本是最有價值的?？醋o者可以進行其他的檢測方法，并使得改變抗生素療法決定的立即必要性得到阻止。實驗室必須繼續(xù)進行細胞毒素測定，這使得周轉(zhuǎn)時間增加，或者培養(yǎng)和毒素測驗的時間增加。然而，兩步方法是最有效的。
3 艱難梭菌的快速檢測方法
目前市場上有很多艱難梭菌快速檢測方法，其中以Meridian Premier C. difficile Toxin A+B ELISA, TechLab Tox A/B Quik Chek, TechLab Toxin A/B II, ImmunoCard Toxin A&B的檢測效果相對較好。ImmunoCard Toxin A&B test最大化地縮短了檢測時間，整個過程為16-24分鐘。另外，這種測驗是一個單項測驗EIA，可能在臨時檢測的應用上是實用可行的。其他的快速檢測方法需要自動板閱讀設備、板清洗機、或者一些消耗品（如不包括在檢測試劑盒在內(nèi)的準備試劑盒等）。大多數(shù)的研究都強調(diào)，需要更加縝密的方法如CTA或者厭氧培養(yǎng)等，以確認快速檢測的結果。另外，快速檢測可以用來作為鑒定艱難梭菌陽性個體的初步的篩選方法，可以減少在艱難梭菌感染檢測的延誤。但是這些快速檢測普遍存在靈敏度低和陽性預測值率等缺點[5]。因此，臨床上迫切需要一種快速靈敏的艱難梭菌檢測方法。
4 艱難梭菌分子生物學檢測方法
目前的有研究表明，利用分子學方法進行艱難梭菌檢測更有效[12,13]。 Peterson 等評價了real- time PCR檢測是利用引物以毒素B基因的一段保守區(qū)域為靶點。 由于所有產(chǎn)毒菌株都攜帶毒素B（有些缺少毒素A），這被視為是產(chǎn)毒菌株的很好的替代標記。
這個研究是分兩個階段進行。第一階段是將送到實驗室的618個艱難梭菌檢測標本，進行普通的EIA測驗與PCR測驗比較。與結合毒素測驗的厭氧培養(yǎng)的金標準比較，EIA的靈敏度為67%，精確度為92%，而PCR的靈敏度為94%，準確度為97%。在這個階段，調(diào)查者還設定了一套明確艱難梭菌相關性腹瀉診斷的標準，并發(fā)現(xiàn)幾乎所有真正的CDAD病例每天會有3次或者更多的排便。對符合該標準的采自病人的370個標本，PCR檢測的靈敏度比EIA的更高（93% vs. 73%）。real-time PCR和厭氧培養(yǎng)測定皆比酶免疫測定（EIA）更加靈敏(P<.01 to P<.05)。作者總結，與EIA相比，real-time PCR是一個更加靈敏，相對迅速的測驗，應該在臨床實踐中考慮替代用來檢測毒性艱難梭菌的酶免疫測定。
目前市場上推出的艱難梭菌快速分子檢測有BD GeneOhm real-time PCR test和Cepheid公司的GeneXpert C. difficile快速檢測方法等。Stamper等（2009）評價了BD GeneOhm real-time PCR test的檢測效果，引用的標準是商業(yè)化應用的CTA（Wampole C.difficile Toxin B test）。通過研究表明，GeneOhm的靈敏度為83.6% (95% CI: 74.3% to 92.9%) ，精確度為98.2% (96.8% to 99.6%)，PPV 和NPV分別為 89.5% (81.5% to 97.4%) 、97.1% (95.3% to 98.9%)。整個GeneOhm real-time PCR test大概需要3h，而一般CTA需要24-48h，厭氧培養(yǎng)的時間大約為5天。作者總結認為，GeneOhm是一個快速靈敏的C.difficile分子檢測方法[14]。
而Cepheid公司推出的GeneXpert C. difficile快速分子檢測，具有更強大的優(yōu)勢。整個檢測過程僅需要30分鐘。與肉湯富集產(chǎn)毒培養(yǎng)進行比較，其靈敏度為93.5%，精確度為94.0%。與現(xiàn)有的PCR檢測、細胞毒素測定、EIA等各種檢測方法比較，其具有高度的靈敏度。因此，相比之下，GeneXpert C. difficile檢測是一種更加快速、靈敏的檢測方法。
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