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一、概述
1.組織取材：組織塊稱重
2.利用液氮、研缽粉碎組織塊
3.加入RIPA 緩沖液（每克組織3ml RIPA），PMSF（每克組織30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron 進(jìn)一步勻漿（15,000 轉(zhuǎn)/分*1 分鐘）維持4℃
4.加入PMSF（每克組織30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30 分鐘
5.移入離心管4℃，約20,000g（約15,000 轉(zhuǎn)）15 分鐘
6.上清液為細(xì)胞裂解液可分裝-20℃保存
7.進(jìn)行Bradford 比色法測定蛋白質(zhì)濃度
8.取相同質(zhì)量的細(xì)胞裂解液（體積*蛋白質(zhì)濃度），并加等體積的2×電泳加樣緩沖液
9.沸水浴中3 分鐘
10.上樣
11.電泳（濃縮膠20mA，分離膠35mA）
12.電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜（100mA 40 分鐘）
13.膜用麗春紅染色，膠用考馬斯亮藍(lán)染色
14.Westernblot 試劑盒顯色
15.分析比較記錄
二、Western Blotting 具體實(shí)驗(yàn)步驟
1.收集蛋白樣品(Protein sample preparation)
可以使用適當(dāng)?shù)牧呀庖毫呀赓N壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品。對(duì)于某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白，例如細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白等，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組份蛋白，也可以使用試劑盒進(jìn)行抽提。收集完蛋白樣品后，為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致，需要測定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同，需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y定方法。
2.電泳(Electrophoresis)
（1）SDS-PAGE 凝膠配制
（2）樣品處理
在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液。例如2X 或5X 的SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液。使用5X 的SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。
（3）上樣與電泳
冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE 膠加樣孔內(nèi)即可。為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，最好使用預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。電泳時(shí)通常推薦在上層膠時(shí)使用低電壓恒壓電泳，而在溴酚藍(lán)進(jìn)入下層膠時(shí)使用高電壓恒壓電泳。對(duì)于Bio-Rad 的標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置或類似電泳裝置，低電壓可以設(shè)置在80-100V，高電壓可以設(shè)置在120V 左右。SDS-PAGE 可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求。為了電泳方便起見，也可以采用整個(gè)SDS-PAGE 過程恒壓的方式，通常把電壓設(shè)置在100V，然后設(shè)定定時(shí)時(shí)間為90－120 分鐘。設(shè)置定時(shí)可以避免經(jīng)常發(fā)生的電泳過頭。通常電泳時(shí)溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳，或者可以根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況，預(yù)計(jì)目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后即可停止電泳。
3.轉(zhuǎn)膜(Transfer)
我們推薦在Western 實(shí)驗(yàn)中選用PVDF 膜。**纖維素膜(NC 膜)或PVDF 膜（二氟化樹脂膜膜孔徑：0.45um)也可以使用，但**纖維素膜比較脆，在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開。膜的使用請(qǐng)參考生產(chǎn)商的推薦使用步驟。具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越短。在轉(zhuǎn)膜過程中，特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時(shí)，通常會(huì)有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象，最好把轉(zhuǎn)膜槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，通常分子量最大的1-2 條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色液對(duì)膜進(jìn)行染色，以觀察實(shí)際的轉(zhuǎn)膜效果。也可以用考馬斯亮藍(lán)快速染色液對(duì)完成轉(zhuǎn)膜的
SDS-PAGE 膠進(jìn)行染色，以觀察蛋白的殘留情況。
4.封閉(Blocking)
轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western 洗滌液中，漂洗1-2 分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。用微型臺(tái)式真空泵吸盡洗滌液，加入Western 封閉液，在搖床上緩慢搖動(dòng),室溫封閉60 分鐘。對(duì)于一些背景較高的抗體，可以在4℃ 封閉過夜。
5.一抗孵育(Primary antibody incubation)
參考一抗的說明書，按照適當(dāng)比例用Western 一抗稀釋液稀釋一抗。用微型臺(tái)式真空泵吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。如果一抗孵育一小時(shí)效果不佳，可以在4℃緩慢搖動(dòng)孵育過夜?；厥找豢?。加入Western 洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10 分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5-10 分鐘。共洗滌3 次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。
6.二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
參考二抗的說明書，按照適當(dāng)比例用Western 二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗。用微型臺(tái)式真空泵吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)?；厥斩梗尤隬estern 洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10 分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5-10 分鐘。共洗滌3 次。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。
7.蛋白檢測(Detection of proteins)
參考相關(guān)說明書，使用BeyoECL, Western 熒光檢測試劑等ECL 類試劑來檢測蛋白。洗片時(shí)可以使用X 光片自動(dòng)洗片機(jī)。如果沒有自動(dòng)洗片機(jī)，可以用顯影定影試劑盒自行配制顯影液和定影液進(jìn)行手工洗片。
8、膜的重復(fù)利用(Membrane recovery)
如果蛋白樣品非常寶貴，可以使用Western 一抗二抗去除液處理蛋白膜，以重復(fù)利用蛋白膜。
三、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)
1.把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到**纖維膜上；
a. 轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌凝膠和**纖維素膜，將**纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml 移液管在凝膠上來回滾動(dòng)去除所有的氣泡
b. 在凝膠/濾膜外再包一張3mm 濾紙（預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕），將凝膠夾在中間，保持濕潤和沒有氣泡
c. 將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中，凝膠面向陰極
d. 將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液以淹沒凝膠
e. 按照廠家所示接通電源開始電泳轉(zhuǎn)移
f. 轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠
2.將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量標(biāo)準(zhǔn)顯現(xiàn)時(shí)取出，記錄下標(biāo)準(zhǔn)位置；
3.用100ml 水洗滌纖維素膜，必要時(shí)可用脫色緩沖液；
4.膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1 小時(shí)；
5.室溫下，用PBS-Tween 緩沖液洗滌薄膜
6.用封口機(jī)將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣；
7.袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊；
8.混合：NGS(100 微升)，印跡緩沖液中的抗體（2.5-5 毫升），加在裝薄膜的袋中，于室溫下?lián)u動(dòng)2 小時(shí)（或4℃過夜）；
9.用總體積300ml PBS-Tween 緩沖液，分4 次在一淺盤中洗滌薄膜，每次75ml；
10.將連接生物素的羊抗兔IgG（40 微升溶于10 毫升印跡緩沖液/100 微升 NGS）加在袋內(nèi)，于室溫下?lián)u動(dòng)1 小時(shí)；
11.按步驟9 洗滌；
12.加入抗生素蛋白-HRP（40 微升溶于10 毫升印跡緩沖液/100 微升 NGS），于室溫下?lián)u動(dòng)；
13.Western Blot 中轉(zhuǎn)移在膜上的蛋白處于變性狀態(tài)，空間結(jié)構(gòu)改變，因此那些識(shí)別空間表位的抗體不能用于Western Blot 檢測。這種情況可以將表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶標(biāo)記親和素進(jìn)行Western Blot。實(shí)驗(yàn)中取膠和膜需帶手套。
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