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流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, FCM）是一種在功能水平上對(duì)單細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行定量分析和分選的檢測(cè)手段，它可以高速分析上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，并能同時(shí)從一個(gè)細(xì)胞中測(cè)得多個(gè)參數(shù)，與傳統(tǒng)的熒光鏡檢查相比，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)。
工作原理：
將待測(cè)細(xì)胞染色后制成單細(xì)胞懸液。用一定壓力將待測(cè)樣品壓入流動(dòng)室，不含細(xì)胞的磷酸緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測(cè)樣品流成一定角度，這樣，鞘液就能夠包繞著樣品高速流動(dòng)，組成一個(gè)圓形的流束，待測(cè)細(xì)胞在鞘液的包被下單行排列，依次通過(guò)檢測(cè)區(qū)域。流式細(xì)胞儀通常以激光作為發(fā)光源。經(jīng)過(guò)聚焦整形后的光束，垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細(xì)胞在激光束的照射下，產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。這兩種信號(hào)同時(shí)被前向光電二極管和90°方向的光電倍增管接收。光散射信號(hào)在前向小角度進(jìn)行檢測(cè)，這種信號(hào)基本上反映了細(xì)胞體積的大?。粺晒庑盘?hào)的接受方向與激光束垂直，經(jīng)過(guò)一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個(gè)不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)。這些熒光信號(hào)的強(qiáng)度代表了所測(cè)細(xì)胞膜表面抗原的強(qiáng)度或其核內(nèi)物質(zhì)的濃度，經(jīng)光電倍增管接收后可轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，再通過(guò)模/數(shù)轉(zhuǎn)換器，將連續(xù)的電信號(hào)轉(zhuǎn)換為可被計(jì)算機(jī)識(shí)別的數(shù)字信號(hào)。計(jì)算機(jī)把所測(cè)量到的各種信號(hào)進(jìn)行計(jì)算機(jī)處理，將分析結(jié)果顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上，也可以打印出來(lái)，還可以數(shù)據(jù)文件的形式存儲(chǔ)在硬盤(pán)上以備日后的查詢或進(jìn)一步分析。檢測(cè)數(shù)據(jù)的顯示視測(cè)量參數(shù)的不同由多種形式可供選擇。單參數(shù)數(shù)據(jù)以直方圖的形式表達(dá)，其X軸為測(cè)量強(qiáng)度，Y軸為細(xì)胞數(shù)目。一般來(lái)說(shuō)，流式細(xì)胞儀坐標(biāo)軸的分辨率有512或1024通道數(shù)，這視其模數(shù)轉(zhuǎn)換器的分辨率而定。對(duì)于雙參數(shù)或多參數(shù)數(shù)據(jù)，既可以單獨(dú)顯示每個(gè)參數(shù)的直方圖，也可以選擇二維的三點(diǎn)圖、等高線圖、灰度圖或三維立體視圖。細(xì)胞的分選是通過(guò)分離含有單細(xì)胞的液滴而實(shí)現(xiàn)的。在流動(dòng)室的噴口上配有一個(gè)超高頻電晶體，充電后振動(dòng)，使噴出的液流斷裂為均勻的液滴，待測(cè)定細(xì)胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴充以正負(fù)不同的電荷，當(dāng)液滴流經(jīng)帶有幾千伏特的偏轉(zhuǎn)板時(shí)，在高壓電場(chǎng)的作用下偏轉(zhuǎn)，落入各自的收集容器中，不予充電的液滴落入中間的廢液容器，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分離。
PI 染色操作步驟
1、將單細(xì)胞懸液加入2ml圓底離心管中，離心，1500rpm , 5min，棄上清液。
2、加入PBS 1ml離心洗滌1次，棄上清。
3、加入2ml預(yù)冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定過(guò)夜。
4、離心，棄上清液。
5、用1×PBS 1ml洗滌1次，離心。
6、加入RNase A (工作濃度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，離心。
7、用1×PBS 1ml洗滌1次，離心。
8、加入PI(工作濃度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室溫避光孵育30min。
9、混勻，過(guò)300目篩網(wǎng)，置流式管中， 4℃冰箱保存，待測(cè)。
GFP PI染色操作步驟
1、將單細(xì)胞懸液加入2ml圓底離心管中，離心，1500rpm , 5min，棄上清液。
2、加入PBS 1ml離心洗滌1次，棄上清。
3、加入2ml預(yù)冷PFA，PFA的濃度根據(jù)細(xì)胞的特點(diǎn)進(jìn)行調(diào)節(jié)，4℃固定30min。
以下步驟同PI 染色操作步驟的（4-9）
細(xì)胞表面直接免疫熒光染色操作步驟
1、將單細(xì)胞懸液加入2ml圓底離心管中，離心，1500rpm，5min，棄上清液。
2、以冷PBA 1ml，離心洗滌，棄上清液。
3、加入用PBA稀釋的熒光素標(biāo)記的抗體200ul。用微量移液器輕輕吹打混勻，4℃或置冰上孵育30min-1h。
4、離心棄上清液。
5、加入冷PBS1ml,離心洗滌2次，以除去未結(jié)合的多余抗體成分。
6、向細(xì)胞中加入冷PBS 500ul,吹打混勻，置流式管中，4℃避光保存，待測(cè)。
細(xì)胞表面間接免疫熒光染色操作步驟
1-2、同細(xì)胞表面直接免疫熒光染色操作步驟
3、 用PBA稀釋的第一抗體200ul，對(duì)照管加入對(duì)應(yīng)于一抗的正常實(shí)驗(yàn)動(dòng)物IgG，輕輕吹打混勻，4℃或置冰上孵育1.5-2h。離心，棄上清。
4、 BS1ml離心洗滌1次，以去除多余的未結(jié)合的特異性抗體。
5、 PBA適當(dāng)稀釋的熒光素標(biāo)記的第二抗體200ul。吹打混勻，4℃或置冰上孵育30min，避光。
6、 PBS 1ml離心洗滌2次。
7、將細(xì)胞重新懸浮于500ulPBS中，混勻，置流式管中，避光，4℃冰箱保存，待測(cè)。
胞內(nèi)直接免疫熒光染色操作步驟
1、將單細(xì)胞懸液加入2ml圓底離心管中，離心，1500rpm , 5min，棄上清液。
2、用1×PBS1ml洗滌1次，離心。
3、4%PFA 1ml，4℃固定30min。
4、用1×PBS1ml洗滌1次，離心。
5、0、1% Triton-100 1ml, 室溫10min。
6、用1×PBS1ml洗滌1次，離心。
7、加入用PBA稀釋的熒光素標(biāo)記的抗體200ul，用微量移液器輕輕吹打混勻，4℃或置冰上孵育30min-1h。
8、離心棄上清液。
9、加入冷PBS1ml,離心洗滌2次，以除去未結(jié)合的多余抗體成分。
10、向細(xì)胞中加入冷PBS500ul,吹打混勻，置流式管中，4℃避光保存，待測(cè)。
胞內(nèi)間接免疫熒光染色操作步驟
1-6、同胞內(nèi)直接免疫熒光染色操作步驟
7、加入用PBA稀釋的第一抗體200ul，對(duì)照管加入對(duì)應(yīng)于一抗的正常實(shí)驗(yàn)動(dòng)物IgG，輕輕吹打混勻，4℃或置冰上孵育1、5-2h。離心，棄上清。
8、冷PBS1ml離心洗滌1次，以去除多余的未結(jié)合的特異性抗體。
9、加入PBA適當(dāng)稀釋的熒光素標(biāo)記的第二抗體200ul。吹打混勻，4℃或置冰上孵育30min，避光。
10、冷PBA1ml離心洗滌2次。
11、將細(xì)胞重新懸浮于500ulPBS中，混勻，置流式管中，避光，4℃冰箱保存，待測(cè)。
備注：
1、RNase A：貯液濃度：1mg/ml；
工作液配制：加1 mg/ml貯液 10ul于500ul 1×PBS中，使終濃度為 20ug/ml。
2、PI：貯液濃度：2、5mg/ml；
工作液配制：加2、5 mg/ml貯液 10ul于500ul 1×PBS中，使終濃度為 50ug/ml。
3、PBA：即PBS加1-2% 牛血清白蛋白，加0、1%疊氮鈉。
4、檢測(cè)樣品細(xì)胞濃度1x106 /ml。
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